膜透過ペプチド融合シャペロニン複合体のドラッグデリバリーシステムへの応用

真正細菌の可溶性画分に存在するシャペロニンGroEL（Cpn60）はダブルリング構造をもつタンパク質で、ATP依存的にコシャペロニンGroES（Cpn10）と結合し、リング入口に捕捉した変性タンパク質を内腔に落とし込み構造形成を介助する。その反応サイクル時間はATP加水分解時間で決まり、大腸菌の野生型GroELは8秒でGroES、ADP、内包したタンパク質を放出するが、当研究室ではATP加水分解に重要なアミノ酸Asp-52、Asp-398を別のアミノ酸に置換することで最長約12日間まで複合体を維持できることを見出した。我々は、天然に存在するナノサイズのタンパク質性カプセルであるシャペロニンGroEL/GroESに着目し、薬物送達システム（DDS）の新規キャリア開発を検討している。N末端に膜透過と核移行のシグナルを付加したGroES変異体とGroELの複合体は、内包した物質を細胞内と核内へ送達したことより、細胞へのDDSキャリアとして有用であると示した。本研究では異なる生物由来のシャペロニンを用いて、DDSキャリアに最適なシャペロニン複合体の組み合わせを評価する。

DDSキャリアに最適な複合体の評価は、シャペロニンとコシャペロニンの結合強度、物質内包、複合体安定性の点で行い、大腸菌由来のGroEL/GroESと真核生物ミトコンドリア由来のmtCpn60/mtCpn10を用いて（図1-A）、分子間相互作用解析の結果から評価を行った。
シャペロニンとコシャペロニンの結合強度は、等温滴定カロリメトリーを用いて測定した。mtCpn60/mtCpn10、GroEL/mtCpn10、GroEL/GroESはATP存在下で相互作用を示したが、mtCpn60/GroESの結合熱は検出できなかった。そのため、Biacoreを用いて、結合による質量変化を測定した結果、固定化したGroESに対してmtCpn60はGroELの1/5程度の結合量であった。このことから、mtCpn60とGroESは結合できるがアフィニティーが非常に弱いことが示唆された。次に、複合体に物質が内包できるか、タンパク質Rhodaneseを用いて活性測定を行った。GroEL/GroESのRhodanese活性を100%とすると、mtCpn60/mtCpn10は85%、GroEL/mtCpn10は87%であり、Rhodaneseを内包できることを示したが、mtCpn60/GroESでは9%であった。最後に、複合体安定性解析をHPLCゲル濾過クロマトグラフィーで測定したところ、mtCpn60/mtCpn10、GroEL/mtCpn10、GroEL/GroESは複合体のピークを示したが、mtCpn60/GroESは複合体をほとんど示さなかった（図1-B）。
今回の結果から、GroEL/GroESに加えて、mtCpn60/mtCpn10、GroEL/mtCpn10を新たなDDSキャリアのカプセルの候補に決定した。真核生物由来ミトコンドリアシャペロニンを用いたDDSキャリアは、ヒトへ投与する時の生体適合性の点で期待できる。