組換えグルカナーゼ（BGL2）の局在を指標とした 小胞輸送阻害物質探索系の構築

カビや酵母などが原因で引き起こされる感染症の新たな治療薬となる物質を、生薬から探すことがこの研究の目的です。しかし、細胞レベルでみるとヒトとカビ、酵母では細胞構造が非常に似ているため、新薬の開発は難航しています。
そこで、生物が自身の細胞が正しく働くため、また、細胞の成長のために、その細胞内外で様々な物質のやりとりを行っていることに着目しました。酵母やカビもまた成長する場所に、様々な物質の輸送を行っています。この物質の輸送を阻害することができれば、酵母やカビの成長を阻止し、増殖を防ぐことができると考えています。

系に用いるプラスミドの改良を行った。今回BGL2の影響を改善するために3つの方法を考え、プラスミドを作製した。pYES2-siganal-EmGFP、pYES2-signal-EmGFP-C-terminal sequence 、pYES2-BGL2(E to A)-EmGFP、pYES2-BGL2(E to D)-EmGFP である。1種類めのpYES2-siganal-EmGFPは、既存の系で使用されているプラスミド（pYES2-BGL2-EmGFP）から、BGL2の小胞輸送シグナル以外の部分を除去した。pYES2-BGL2-EmGFPを保有する大腸菌（DH5α）を培養し、プラスミドを抽出した後、リン酸化したプライマーを用いてインバースPCRを行った。DpnⅠを用いて大腸菌由来のDNAを消化した後、ライゲーションした。これを大腸菌（DH5α）に形質転換を行い、37℃で一晩インキュベートした。生えてきたコロニーをピックアップして、コロニーPCRでインサートチェックを行った後、アルカリプレップ法にてプラスミド抽出をし、プラスミドを鋳型にシーケンス解析（外注）を行った。ここで作製したプラスミドをpYES2-signal-EmGFPとする。pYES2-signal-EmGFPを、大腸菌（DH5α）に形質転換した。得られた形質転換体をランダムにピックし、インサートの有無を確認した後プラスミドを抽出して、PCRにて確認した。その結果をFig.1に示す。

Fig.1より目的分子量付近にバンドを確認することができたため、目的のプラスミドを構築することができたとして、配列の確認を行った。その結果配列は、予測した配列と一致しており、変異などは確認されなかった。
2種類めのpYES2-signal-EmGFP-C-terminal sequenceは、1つめのプラスミドの蛍光タンパクのC末端部分にBGL2が持つ細胞壁結合配列を付加したものを作製した。こちらのプラスミドを作製する際には、インサートに外注した配列を用いた。1つめのプラスミドと同様の方法で作製、構築の確認を行ったところ目的プラスミドを構築することができたことが示唆された。
3種類めのpYES2-BGL2(E to A)-EmGFP、pYES2-BGL2(E to D)-EmGFPは、BGL2の活性部分のアミノ酸を変更することで、その活性を失わせるという考えのもと、プラスミドを作製した。こちらのプラスミドを作製する際にも、インサートに外注した配列を用いた。2種類めのプラスミドと同様の方法で作製、構築の確認を行ったところインサート部分に7箇所の変異が確認された。アミノ酸に変換したところ3か所の変異が見られたが、発色団を構成するアミノ酸に変異が認められなかったため、このプラスミドを今後の実験に使用することとした。