Propionibacterium acnesリパーゼ阻害剤のスクリーニング法の開発

アクネ菌と呼ばれるPropionibacterium acnes（P.acnes）は、ニキビの原因菌として知られていますが、そのメカニズムは明らかになっていませんでした。しかし、近年、アクネ菌が分泌するリパーゼがニキビの要因になることが明らかになりました。そのメカニズムは、皮脂腺内のトリアシルグリセロールをアクネ菌のリパーゼで分解して生じた脂肪酸が、毛穴から分泌できなくなることによりニキビが生じるというものです。そのため、リパーゼに対する阻害剤は、新たなニキビ治療薬の発見に貢献できるのではないかと考えました。本研究の特徴として、ヒトも同様なリパーゼを持つため、ヒトには効果を示さず、アクネ菌のみに効果を示す阻害剤を見つけることを研究室独自の方法を用いて取り組みました。

(1)発現ベクターの構築
P.acnes(NBRC107605）を37℃で2日間嫌気培養を行った。得たコロニーからゲノム抽出を行い、目的の遺伝子配列をPCRにて増幅し、電気泳動とシークエンス解析を行った。得たPCR産物とpCold ⅠをEcoRⅠとNdeⅠで制限酵素処理（37℃、2h）をし、ライゲーション（16℃、2h）を行った。そして、大腸菌（Dh5α）に形質転換（37℃,一晩）を行い、得た形質転換体を用いて、PCRによりインサートを確認し、ベクターが構築できているかを確認した。
(2)タンパク質精製
得た形質転換体の培養液をOD₆₀₀値0.4〜0.5の範囲におさめ、浸透培養（15℃、24h）を行った。その後、菌液をLysisbufferで抽出し、His-tag精製を行い、SDS-PAGEで確認した。
(3)リパーゼの活性測定
精製したタンパク質を50µL、リパーゼ活性基質である0.01mMの4-Methylumbelliferyloleate（４−MUO）150µL、およびリン酸緩衝液（pH＝7.5）800µLを加え37℃で40分間反応させた。その後、励起波長375nm、蛍光波長450nmで分光光度計により、蛍光強度を測定した。

(1)タンパク質精製
構築したベクターのインサートは、9つの変異が入っていたが、2つのコロニーで同じ場所に変異が入っていたため、菌株に変異が入っていると考え、このインサートを用いてベクターを構築した。精製したタンパク質をSDS-PAGEで確認した。その結果をFig.1に示す。

目的タンパク質量付近にバンドを確認することができなかった。精製条件を検討する必要がある。また、変異が入っていたため、IDTより人工合成したリパーゼ遺伝子配列をインサートとしたベクターの構築も現在行っている。
(2)リパーゼ活性の測定
4-MUOがリパーゼによって分解され、生産される4-MU（励起波長375nm、蛍光波長450nm）の蛍光強度によってリパーゼ活性を測定した。P.acnesのリパーゼは分泌型であるため、P.acnesを液体培養し、集菌後の上清と精製したタンパク質を用いて活性を測定した。その結果をFig.2に示す。

両方のサンプルで活性を確認することができた。以上の結果をもとに、当該酵素を固定化し、活性評価法の構築に取り組む予定である。