細胞内光クロスリンク技術を用いたシャペロニン複合体の解析

ヒートショックプロテインと呼ばれるシャペロニンGroELは細胞が熱などのストレスを受けた時、短時間で過剰発現し、変性タンパク質の立体構造形成を介助することで、細胞内毒性を示すタンパク質凝集体の形成を防いでいると考えられている。
GroELは7量体のリングが二つ背中合わせに重なったダブルリング構造で、GroELの反応機構では、個々のサブユニットにATPが結合すると立体構造変化をし、ドーム型のGroESと複合体を形成して機能する。GroEL一分子にGroESが1つ結合した弾丸型複合体と、2つ結合したフットボール型複合体があり（図1）、これまでのin vitro研究の結果から、変性タンパク質が多く存在するとき、フットボール型複合体を中間体とする反応経路が選択されると考えている。本研究では、GroESのGroEL結合部位に、UV照射で近傍5Å以内に存在する別のアミノ酸と光架橋する非天然アミノ酸であるパラベンゾイルフェニルアラニン（pBpa）を導入し、UV照射でGroEL/GroES複合体を光架橋する細胞内光クロスリンク技術（図2）を用いて、細胞内GroEL/GroES複合体を安定化させて存在比を解析した。

GroEL/GroES複合体を細胞内光架橋して安定化させるために、大腸菌MGM100株（ゲノム上のgroES、groELの発現をアラビノースプロモーターで制御することが出来る大腸菌）を、GroES変異体とGroELの発現ベクターで形質転換し、pBpaを含有した最小培地で培養後、培養液を紫外線照射し、細胞内で形成されたGroES/GroEL複合体を光架橋した。菌体破砕液をSDS-PAGEおよびNative-PAGEで分離し、ウェスタンブロットと画像解析ソフトImageJを用いてGroEL/GroES複合体を定量した。
37℃培養時に細胞内で光架橋されたGroEL-GroESの形成率は、抗GroES抗体と抗GroEL抗体でそれぞれ約6%、7%と定量でき、実験条件の中で最も低い値を示した。一方、37℃培養後に42℃に30分暴露した条件では、抗GroES抗体と抗GroEL抗体で59%、42％となり、光架橋したGroEL-GroESが最も多く検出された。これは、GroEL/GroES複合体存在比が培養温度によって変化する可能性を示唆した。
菌体破砕液をNative-PAGEで分離しウェスタンブロット解析したところ、37℃から45℃に温度シフトした条件でのみ、フットボール型のリング界面が7°ねじれて割れることで形成されるシングルリング複合体（図1）を検出した。高温に暴露したときでのみシングルリング複合体を検出したことから、細胞内で変性タンパク質濃度が増加するとされる熱ストレス下で、フットボール型複合体が形成されたことを示唆した。