コラーゲン由来のコラーゲントリペプチドによるコラーゲン発現誘導機構の解析

動物の体は細胞と、細胞が分泌するコラーゲンなどからなる細胞外マトリックス（ECM）で構成されている。コラーゲンなどの産生と分解のバランスによってECMは維持されるが、加齢とともにバランスが失われる。これによって肌にしわやたるみが生じ、血管はもろくなる。当研究室ではコラーゲンを加水分解した化合物であるコラーゲントリペプチド（CTP）が実験動物である線虫やヒト培養細胞に作用することで、細胞内の情報伝達に関わるp38 MAPK経路を介してコラーゲン発現を誘導し、老化を抑えることを明らかにしている。しかし、CTPによるコラーゲン発現誘導に必要なしくみの全体像は明らかになっていない。そこで、きわめて多様な生理活性を有するTGF-β経路と、TGF-β受容体によって活性化し、転写制御を行うSmad経路に着目し、CTPの受容からコラーゲン産生に至る抗老化のしくみを明らかにすることを目指す。

(1) 寿命測定実験
TGF-βⅠ型受容体欠損変異体線虫であるsma-6及び R-Smad欠損変異体線虫sma-2を用いて寿命測定実験を行った。NGMアガー培地で成虫まで飼育したsma-6変異体線虫をコントロールとして滅菌水、CTP（最終濃度 100μg/mL）を添加した寿命用培地に移し、2 日ごとに測定し、生存率を算出した。なお、4日ごとに新しい培地と交換した。
(2) 遺伝子発現解析
NGMアガー培地で成虫まで飼育した線虫をコントロールとして滅菌水、CTP（最終濃度 100μg/mL）を添加した短期及び長期飼育培地に移し、一定期間飼育した。その後、線虫をM9バッファーで回収し、RNAiso Plus（タカラバイオ）を用いてRNAを抽出した。このRNAに5×RT Master Mix（東洋紡）を加え、42 ℃（30分）、 98 ℃（5分）で反応させ、cDNAを合成した。合成したcDNAにおけるコラーゲン遺伝子及びMMP関連遺伝子の発現量をリアルタイムPCRで測定した。

(1)寿命測定実験
MAPK経路の活性化は複数の受容体によって引き起こされる。これまでにTGF-βがコラーゲン発現を増加させることが報告されているため、TGF-β受容体に着目した。そこで、CTPにより起こるコラーゲン遺伝子の発現がTGF-β受容体を介しているのか調べるために、sma-6を使い寿命測定実験を行った結果、コントロールと比較して、CTP添加培地で飼育したsma-6変異体線虫の寿命の延長はみられなかった（Fig. 1）。この結果からCTPによる寿命の延長はTGF-βⅠ型受容体が関与していると考えられる。CTPがTGF-βⅠ型受容体を介することは示されたが、TGF-βⅠ型受容体は Smad経路の活性化を導くことも知られている。そこでCTP投与によって発生する寿命延長にSmad経路が関与しているのか調べるために、R-Smad欠損変異体線虫であるsma-2を使い寿命測定実験を行った。その結果、コントロールと比較して、CTP 添加培地で飼育したsma-2変異体線虫の寿命の延長はみられなかった（Fig. 2）。この結果から、CTPによる寿命の延長は TGF-β受容体、そしてTGF-β受容体により直接リン酸化されるSmad経路が関与していると考えられる。

(2)遺伝子発現解析
①TGF-β関連変異体線虫のコラーゲン遺伝子発現解析
CTPにより起こるコラーゲン遺伝子の発現にTGF-β/Smad 経路が関与しているのか調べるために、sma-6変異体線虫、sma-2変異体線虫を使いcol-176遺伝子発現解析をリアルタイムPCRで行った。その結果、sma-6変異体線虫、sma-2変異体線虫の両者ともに、野生型線虫N2のようなコラーゲン遺伝子の発現はみられなかった（Fig. 3A, 3B）。 

②野生型線虫N2のMMP関連遺伝子発現解析
ECMはコラーゲンの産生とMMPによるコラーゲンの分解により恒常性を維持している。そこでCTPを与えた線虫において、MMP関連遺伝子の発現がどのようになっているか調べるために、野生型線虫N2にCTPを与え、線虫のMMP遺伝子であるzmp-3とzmp-5の発現をリアルタイムPCRで調べた。その結果、コントロールと比較してzmp-3、zmp-5ともにCTPを与えた線虫で遺伝子の発現が抑制されていた（Fig. 4A, 4B）。

CTPによる刺激は TGF-β受容体により受容され、主にp38 MAPK経路を介してコラーゲンの発現や、MMPの抑制を行っていると考えられる。また、sma-6、sma-2変異体線虫を用いた実験より、Smad経路もこれらの制御に関わっている可能性も示唆された。