がん細胞にアポトーシスを誘導する化合物の探索

多くのがん細胞ではアポトーシス機能が抑制されており、無限に増殖し浸潤や転移等の悪影響を及ぼす一因となっている。SurvivinはIAP(inhibitor of apoptosis protein)ファミリーに属するタンパク質で、IAPファミリーの特徴であるBIR(baculovirus IAP repeat)ドメインを1つ持つ。がん細胞では、この BIRドメインにおいてSurvivinとHBXIPが相互作用し、複合体を形成することによってアポトーシスを抑制することが知られている。そこでSurvivinとHBXIPの複合体形成を阻害することによって副作用の小さな抗がん剤の開発へ結びつけることができると考える。
本研究の目的は酵母ツーハイブリッド法を利用し、アポトーシスを誘導する生薬を探索することである。

●生薬スクリーニング
SurvivinとHBXIPのベクターを導入した形質転換体酵母を用いて、スクリーニングを行った。実験方法としては5mLのSC-Leu,-Trp,-His液体培地で形質転換酵母を24h培養した。培養した菌液を5mLのSC-Leu,-Trp,-His液体培地に加え、25時間培養した。培養した菌液に生薬抽出物を終濃度100μg/mLになるように添加し、12時間暴露した。培養した菌液を集菌、洗浄を行い、ONPG溶液を加え、30℃で加温して30分間反応させた。その後、反応を停止し、吸光度を測定して、酵素活性を算出した。
●アポトーシス誘導確認　TUNEL染色
アポトーシス誘導の確認のためにTUNEL染色を行った。実験方法としては、培養した細胞を24ウェルプレートに継代を行い、24h培養した。生薬(紫根)を終濃度150、100、75、50、25μg/mLになるように添加し、24h培養した。培養後、トリプシン処理を行い、TdT enzymeとLabeling Safe Bufferで染色を行い、対比染色としてPIを滴下して観察を行った。

●生薬スクリーニング
構築した酵母ツーハイブリットシステムを用いて、生薬135種類の抽出物に対するスクリーニングを行った。その結果、生薬を添加せずに培養した菌液のβ-galactosidase 活性を1としたとき、生薬抽出物を添加することにより、β-galactosidase 活性を70％以上阻害したものは8種類であった(図1)。
●アポトーシス誘導確認　TUNEL染色
先の結果を基に、効果が見られた生薬(紫根抽出物)をB16メラノーマ細胞に滴下し、アポトーシス誘導の確認を行った(図2)。その結果、コントロールではPIによって0.125%の細胞が染色されていたがTUNELによって蛍光染色されている細胞は存在しなかった。一方、紫根抽出物を添加した細胞ではPIによって染色されている細胞の割合はコントロールと差異がなかったが、TUNEL染色によって蛍光染色されている細胞が確認された。このことから、紫根抽出物にアポトーシス誘導を引き起こす成分が含まれていると考えられた。