ヒトにおけるチロシナーゼ遠位調節エレメント CpG islandのDNAメチル化解析

シミは通常皮膚のターンオーバーによって排出されます。しかしメラノサイトの活性化などによりシミとして残ることがあります。シミがいつまでも皮膚に定着している原因はいまだ解明されていません。先行研究により、メラニンを形成する遺伝子領域でメチル化状態には差がないことが示されています。そこでこの領域よりもさらに上流の遺伝子に着目し調べた結果、上流の遺伝子にメラニンを制御する可能性のあるメチル化を多く含む領域を発見しました。そこでこの領域に焦点を当てメラニン形成の場であるメラノサイトでのDNA塩基配列解析およびメチル化解析を行い、白色人種とアジア人種、黒色人種で細胞でのメチル化パターンに差が見られるかを検証しました。この機構を解明することで、シミ治療への発展へとつながることが予測されます。

● NHDFの培養
アジア人のNHDFを10％DMEM、+1％Anti-Antiで8日間培養した。2日に1回程度培地交換を行い、80％コンフルエント時にトリプシンで培地からはがし、ゲノムDNA抽出を行った。
●メラノサイトの培養
白人・アジア人・黒人のヒト正常メラノサイト（NHEM）を254培地+1％Anti-Antiで10日間培養した。1日に1回培地交換を行い、80％コンフルエント時にトリプシンで培地から細胞をはがしDNA抽出を行った。
●DNAメチル化解析
メチル化されていないシトシンをウラシルに変換させるために、EpiTect Fast DNA Bisulfite Kitを用いてバイサルファイト処理およびDNAのclean-upを行った。次にTyrosinase上流のCpG island領域をPCRで増幅させ、アガロースゲル精製を行った。精製したサンプルをシーケンスに提出した。

アジア人種のNHDFおよびメラノサイトでDNA配列の確認を行った結果ヒトのCpG islandにおけるCG配列は22ヶ所存在することが確認できた。このCpG islandのメチル化解析を行った結果を結果をFig.1に示す。

Fig.1よりアジア人のNHDFおよびメラノサイトにおけるCpG islandのCG配列22ヶ所すべてにメチル化されている結果が得られた。このことからチロシナーゼの遠位調節エレメントのメチル化状態が異なり、チロシナーゼ発現に影響している可能性があることが示唆された。これらのシーケンス結果からピークなどから他のDNAも混ざっている可能性が示唆されたため、今後はTAクローニングなどを行い、個々のDNAでメチル化パターンに差があるのか、また個々のDNAを取り出すことが可能か検討する必要がある。