TCpn60/TCpn10のリン酸化による構造安定性と反応調節機構の解析

シャペロニンGroEL/GroESは、熱ストレスで発現誘導される熱ショックタンパク質の1つで、細胞内の変性タンパク質を基質として、正しい構造へ再生する機能を担う。大腸菌のGroELは、14量体ダブルリング構造をもち、ATPとGroESの結合を伴って、リング内部に変性タンパク質を取り込んで正しい構造へと折り畳む。Thermus thermophilusのシャペロニン（TCpn60/TCpn10）は、大腸菌のGroEL/GroESと約70%のアミノ酸一致率を有し、立体構造も類似している。当研究室では、60-90℃まで温度を変えて培養したT. thermophilus HB8株からTCpn60を精製し、リン酸化部位を同定した。培養温度が高いほどリン酸化部位は多くなり、80℃培養で8箇所が同定できた（図1）。本研究では、その内の3箇所のリン酸化部位をアラニンに置換した変異体を作製し、アラニン変異体によるATP加水分解活性への影響を検証する。

TCpn60のリン酸化部位である内の3箇所をそれぞれ1箇所ずつアラニンに置換するベクターをPCRにて作製した。作製したベクターを大腸菌に形質転換した後、3種類のTCpn60変異体を精製した。TCpn60変異体をHPLCゲルろ過クロマトグラフィーにて解析した結果、14量体TCpn60の溶出時間である約20分の位置にピークが検出された。また、モノマーのTCpn60に相当する約35分の位置にもピークが検出された（図2）。ATP再生法によるATP加水分解活性測定を行なった結果、TCpn60変異体は野生型と同等のATP加水分解活性を保持していることが分かった。また、FoldXプログラムを用いて、リン酸基の有無によるエネルギー変化を、TCpn60のリン酸化部位の内、結晶構造が解かれている7箇所計算した結果、正の値への変化が4箇所、負が1箇所、変化がゼロ付近になるのは2箇所であった。正への変化は複合体構造が不安定化、負への変化は安定化を示すと言われており、今後は複数箇所変異導入した変異体を作製し、活性への影響を見る。