Thermus thermophilus 由来線毛関連タンパク質PilOの精製

Ⅳ型線毛は多くのグラム陰性菌の表面に見られる細胞膜、内膜、外膜を貫通するフィラメント状の細胞外構造体である。Thermus thermophilus のⅣ型線毛は少なくとも16種類以上のタンパク質が相互作用することで、固相表面上での滑走運動、自然形質転換による外部DNAの取り込み、ファージ感染、バイオフィルムの形成など、細菌において重要な機能を示す。その内PilN、PilOは内膜局在タンパク質であり、自然形質転換と平面滑走運動に関与する可能性が示唆されている。当研究室ではPilN、PilOの解析のため精製を試みたが、膜タンパク質であるため精製が難航している。本研究ではPilOのベクター構築を行い、精製、抗体を作製することを目的とする。

Thermus thermophilus Ⅳ型線毛関連タンパク質であるPilOは、N末端の9-31a.a.が膜貫通領域であり、疎水性が高いことがわかった。そのため、N末端1-32a.a.を除去した発現ベクターを構築し、大腸菌内で発現させた（PilO⊿1-32、HisPilO⊿1-32）。目的のPilOは大腸菌内で凝集したが、8M Urea の変性剤で可溶化することができた。可溶化させた PilO をHis Trap（アフィニティークロマトグラフィー）とButyl-TOYOPEAL（疎水性相互作用クロマトグラフィー）を用いて精製を行った。結果、精製度95.8%のPilOを1.03g得ることができた。精製したPilOの一部を抗原として用いて抗体の作製を行った。作製した抗体は2500 倍希釈で0.1 µgで特異性の高いシングルバンドで検出され、0.01µgまで検出することができた。