Ⅳ型線毛の構成因子の同定とメカニズム解析

細菌は細胞膜によって自身と外部環境を区別し、物質は自由に細胞膜を通過できないが、細胞膜にフィラメント状に突出したⅣ型線毛（T4P）はDNAなどの細胞内への引き込みや、細胞内で生産したタンパク質の細胞外分泌を可能にしている。T4Pは伸長と退縮をすることで主に運動機能を司るが、トランスポーターの役目も持つため、病原細菌の感染戦略を理解することにも繋がる。T4P構成要素のうちPilF、PilTはATP加水分解酵素であり、線毛の駆動力を生み出すことがわかっているが、その機能を制御するスイッチ機構は明らかになっていない。そこでT4Pタンパク質を精製して相互作用を解析することでT4Pの動く仕組みを考察する。

細胞内の数千ものタンパク質の中から単一の目的タンパク質を得るために、性質の異なるクロマトグラフィーを複数使用して分離し、精製した。精製タンパク質の一部を抗原としてポリクローナル抗体を作製した。精製タンパク質間の相互作用をみるためにマラカイトグリーン法にてATP加水分解活性を測定した。また、寒天培地で培養した生細胞を回収し、シリンジ針で出し入れすることで線毛を物理的に引き抜き、作製した抗体を用いたウェスタンブロット解析により、T4Pに含まれるタンパク質の同定を行った。

精製線毛のウェスタンブロットより、全株の線毛で検出されたPilQ、F、C、TTHA0007はT4Pのコア構造と考えた。一方、PilT1、T2、M、O、Wは、野生株と比較してATP加水分解活性変異／欠損株ともに線毛コア構造に強く結合するようになったため、ATP加水分解と連動する複合体構造変化が示唆された。精製したPilT1、PilT2のATP加水分解活性について、PilM、Cの共存でPilT1のATP加水分解活性は増強され、逆にPilT2はPilT1、C、M、O、の共存により抑制されたことから、線毛の退縮にこれらタンパク質間の相互作用が関与していると考えられた。