抗真菌剤の探索

真菌症とは、私たちの身近に生息しているカビや酵母がヒトに感染することによって引き起こされる感染症です。その中でも、特に症状が重篤化するのは肺や脳などの体内で感染する深在性真菌症です。また、がんや臓器移植などの治療に伴う免疫低下により日和見感染し深在性真菌症を発症することが問題となっています。
現在使用されている抗真菌剤は種類が少ないことに加え、副作用や耐性菌の出現が確認されており、新しい薬剤の開発が急がれています。治療薬が少ない原因として真菌はヒトと細胞構造が似ているため薬剤の開発が難しいということが挙げられます。本研究では真菌のみに作用する新しい薬剤の開発を行うため、真菌に特異的な成長方法である先端成長に着目し、先端成長時の小胞輸送を可視化する評価系を実際の真菌症の原因菌であるC. albicansを用いて構築することで、新たな薬剤の開発に繋げていきたいと考えています。

●C.albicansの形質転換
構築したベクターをエレクトロポレーション法を用いてC. albicansCAI4に形質導入した。前培養したC.albicansを酢酸リチウムで処理した後ソルビトールで懸濁し、pGAL10-sigEmGFPを加え、エレクトロポレーションにかけた後、選択培地に塗布し、培養。形成されたコロニーよりコロニーPCRを行い形質転換されていることを確認した。
●EmGFPの発現確認
形質転換して得られたpGAL10-sigEmGFP in C. albicansにおいてEmGFPを発現しているか確認するため、誘導培養を行い顕微鏡で観察した。SC Ura-2％グルコース培地で選択した形質転換体C.albicansをSC Ura 2％ラフィノース培地で30℃、一晩培養した。次にSC Ura-2％ラフィノース培地に対して10分の1量の前培養物を加え、OD600=0.4になるまで培養し、培地をSC Ura-2％ガラクトース培地に変更し1時間毎にプレパラートを作製し、顕微鏡観察を行いEmGFPの発現を確認した。

●C. albicansの形質転換
pGAL10-sigEmGFP/pRC2312をC.albicansCAI4に形質転換し、形成されたコロニーよりコロニーPCRを行った結果目的分子量付近にバンドが確認された。よって、pGAL10-sigEmGFPが形質転換されたことを示唆している。
●EmGFPの発現確認
形質転換体C.albicansを誘導培養し、EmGFPの発現を確認するため顕微鏡観察を行った結果、C.albicansの菌体を観察することはできたが、蛍光は確認できなかった。
●ベクターの再構築
構築したベクターのGAL10プロモーター領域に塩基置換が確認されたことまた、EmGFPの発現が確認できなかったことより、ベクターの再構築を行った。pRC2312由来のLacプロモーターの欠損を行うためiPCRを行い、Lacプロモーター領域の塩基配列を決定したところLacプロモーター領域が欠損されたことが確認できた。