ストレスで誘因されるシャペロニン翻訳後修飾と活性調節機構の解析

真核細胞では、タンパク質のアミノ酸側鎖の１つにリン酸基を結合する翻訳後修飾が、タンパク質の活性調節や細胞に特定の状態変化を引き起こすシグナルとして機能していることがわかっている。しかし、近年では原核生物にもこのような調節機構があることが明らかになってきた。シャペロニンGroELは、細胞内のタンパク質が熱などのストレスで変性した際にそれらを保護し再生する機能を持つタンパク質である。私たちは、細胞への熱ストレスが引き金となり、シャペロニンがリン酸化することを発見したため、特定のタンパクキナーゼによるリン酸化を介した機能制御機構を明らかにすることを目指している。

生育温度が70〜75˚Cの高度好熱性細菌Thermus thermophilusを60〜90 ˚Cで培養し、それぞれの菌体からシャペロニン（TCpn60）を精製した。質量分析（LC-MS/MS）を用いてリン酸化部位の検出を行ったところ、60℃で培養したT.thermophilusから精製したTCpn60^T60では、リン酸化部位は3ヶ所であったが、80℃で培養したT.thermophilusから精製したTCpn60^T80では8ヶ所のリン酸化部位が検出された（図１）。培養温度が高くなるほどリン酸化修飾部位が増えていたことから、T.thermophilusの熱ストレス応答とシャペロニンのリン酸化は関連していると考えられた。T.thermophilusから精製したTCpn60^T80 と、組換え大腸菌から精製したTCpn60^Eのシャペロニン活性を比較したところ、TCpn60^T80はTCpn60^Eの５倍の変性タンパク質フォールディング活性を示した（図2）。さらに、T.thermophilusのゲノムにコードされるプロテインキナーゼ遺伝子をクローニングし、組換え大腸菌内でTCpn60とプロテインキナーゼを共発現させた。精製したTCpn60のリン酸化部位を検出することで、どのプロテインキナーゼがTCpn60のどのアミノ酸をリン酸化するのかを解析した。