開閉時間の異なるシャペロニン複合体を利用した細胞内DDSシステムの評価

シャペロニンGroELはカゴ型構造を持ち、フタ型構造のGroESがATPの加水分解を伴って結合し、直径約5 nmの空間をもつカプセル構造のGroEL/GroES複合体を形成する。その際に変性タンパク質が複合体内部に落とし込まれ正しい構造に折り畳まれる（フォールディング）。複合体の開閉時間はATP加水分解時間によって決まり、ATPの加水分解が終了すると、ADPとGroESが解離して内包物も放出される。当研究室では、8秒〜12日までの様々なサイクル時間を持つGroEL変異体ライブラリーを保有している。GroELはタンパク質の他に金属ナノ粒子や化合物等を内包することが可能であることから、薬剤送達システム（DDS）のためのタンパク質性ナノカプセルとしての応用を目指している。
これまで、膜透過ペプチドと核移行シグナルを付加したGroES変異体とGroEL変異体の複合体は、細胞添加後1時間以内に細胞膜内に入り、4.5時間以内に核に送達されることがわかっている。そこで本研究では、開閉時間の異なるGroEL変異体とシグナルペプチド付加したGroES変異体の複合体を用いて、核送達後の内包物の放出時間を制御することを目的とする。

当研究室が保有するGroEL変異体ライブラリーから開閉時間が4.5時間前後であると予想されるGroEL変異体5種を精製後、正確な開閉時間を測定するためGroELに結合したヌクレオチドを定量した。その結果、開閉時間が1.0、2.8、4.6、6.0、26時間のGroEL変異体を得ることができた。また、GFPフォールディング活性測定を行い、全ての変異体でGFPを内包し、フォールディングが可能であることがわかった。
5種類の変異体の中で、開閉時間が1.0、4.6、26時間のGroEL変異体を用いて、GroES変異体との複合体に変性GFPを内包させ動物細胞に添加し、細胞内でのGFPの蛍光を観察した。予想通り開閉時間が1.0時間のGroEL変異体では核までGFPが送達されていないように見られた（図1-A）が、4.5時間以上のGroEL変異体では核までGFPが送達されているように見られた（図1-B、C）。他の変異体でも細胞でのGFPの挙動を観察し、目的の時間で薬剤を局所でのみ放出できるDDSキャリアへの応用を目指す。