卒業研究のご紹介
2019年版

化学・バイオ・栄養系

ヒトにおけるチロシナーゼ遠位調節エレメント CpG islandのDNAメチル化解析

竹中 亜里沙愛知県
応用バイオ科学部応用バイオ科学科 2019年3月卒業
愛知県立天白高等学校出身

研究の目的

シミは通常皮膚のターンオーバーによって排出されます。しかしメラノサイトの活性化などによりシミとして残ることがあります。シミがいつまでも皮膚に定着している原因はいまだ解明されていません。先行研究により、メラニンを形成する遺伝子領域でメチル化状態には差がないことが示されています。そこでこの領域よりもさらに上流の遺伝子に着目し調べた結果、上流の遺伝子にメラニンを制御する可能性のあるメチル化を多く含む領域を発見しました。そこでこの領域に焦点を当てメラニン形成の場であるメラノサイトでのDNA塩基配列解析およびメチル化解析を行い、白色人種とアジア人種、黒色人種で細胞でのメチル化パターンに差が見られるかを検証しました。この機構を解明することで、シミ治療への発展へとつながることが予測されます。

研究内容や成果等

■ 実験方法

● NHDFの培養
アジア人のNHDFを10%DMEM、+1%Anti-Antiで8日間培養した。2日に1回程度培地交換を行い、80%コンフルエント時にトリプシンで培地からはがし、ゲノムDNA抽出を行った。
●メラノサイトの培養
白人・アジア人・黒人のヒト正常メラノサイト(NHEM)を254培地+1%Anti-Antiで10日間培養した。1日に1回培地交換を行い、80%コンフルエント時にトリプシンで培地から細胞をはがしDNA抽出を行った。
●DNAメチル化解析
メチル化されていないシトシンをウラシルに変換させるために、EpiTect Fast DNA Bisulfite Kitを用いてバイサルファイト処理およびDNAのclean-upを行った。次にTyrosinase上流のCpG island領域をPCRで増幅させ、アガロースゲル精製を行った。精製したサンプルをシーケンスに提出した。

■ 実験結果および考察

アジア人種のNHDFおよびメラノサイトでDNA配列の確認を行った結果ヒトのCpG islandにおけるCG配列は22ヶ所存在することが確認できた。このCpG islandのメチル化解析を行った結果を結果をFig.1に示す。

Fig.1 NHDF. Melanoscyteメチル化解析結果
Fig.1よりアジア人のNHDFおよびメラノサイトにおけるCpG islandのCG配列22ヶ所すべてにメチル化されている結果が得られた。このことからチロシナーゼの遠位調節エレメントのメチル化状態が異なり、チロシナーゼ発現に影響している可能性があることが示唆された。これらのシーケンス結果からピークなどから他のDNAも混ざっている可能性が示唆されたため、今後はTAクローニングなどを行い、個々のDNAでメチル化パターンに差があるのか、また個々のDNAを取り出すことが可能か検討する必要がある。
指導教員からのコメント 教授 飯田 泰広
メラニンは紫外線から皮膚を守るために重要ですが、過剰な産生はシミの原因になります。チロシナーゼは、そのメラニンを合成する酵素であり、この発現を調節することが可能になれば新たな美白剤になると考えられます。一方、シトシンとグアニン(CpG)が多い配列のシトシンがメチル化されると発現が抑制されることが知られています。竹中さんは、チロシナーゼ遺伝子の上流に存在しているCpG配列のメチル化状態がメラノサイト細胞において細胞のメラニン産生状態との相関を調べることを行いました。
卒業研究学生からの一言 竹中 亜里沙
神奈川工科大学では資格の支援や留学制度、就職支援など制度が整っており、台湾への短期留学や教員免許取得など4年間充実した大学生活を送ることができました。応用バイオ科学科のカリキュラムでは自主テーマ実験が印象的です。1、3年次にグループで実験を計画から発表まで行うもので、関わりのなかった同級生と協力することで絆が深まり、新たな交友関係を築くことができました。また研究室では毎日仲間たちと助け合いながら、自分の研究が将来医療分野に貢献できると思うと結果が出ない研究も頑張れました。日々集中して研究に臨むことができ、論理的思考力や研究スキルを身につけられました。